题目

质粒转染细胞不表达的问题~
想研究某跨膜蛋白,构建真核表达质粒（构建了多种,载体有PCDNA3.1-FLAG,PCDNA3,1-V5,PCMV-5'端MYC,PCDNA3-5'FLAG,PCDNA3-5'HA）,转染始终不表达,细胞换过293T,AD293,COS1,COS7等,转染操作的人也换了好几个,始终检测不到目的条带~质粒酶切鉴定和测序都正确,不存在移码和无义突变,启动子序列也正确,起始密码子和终止密码子的问题也考虑了,实在想不出有别的什么问题了,希望有人能帮我分析一下,

提问时间：2021-05-25

答案

不知道你没杂出条带是因为什么原因,还有你杂交的抗体是目的蛋白的抗体吗?你杂杂标签蛋白试试,看看有没有条带啊?我这么说是因为,膜蛋白确实不好提取,而且提取后可能空间构想改变了,你的抗体可能识别不了了,而标签蛋白是多肽,构象不会受影响,只要不被你的目的蛋白档上就行,所以你可以用标签蛋白的抗体杂交下,试试.一般最好把标签和目的蛋白融合表达一下