题目
制备单克隆抗体的过程
提问时间:2020-08-03
答案
(一)脾细胞 1.材料 (1)免疫过的血清抗体滴度高的Balb/c鼠.(2)1640培养液 单克隆抗体制备流程
(3)2.5%FCS-1640营养液 2.操作方法 (1)拉颈或用CO2处死小白鼠.(2)将小鼠放于70%酒精中浸泡消毒,取出固定于板上,在无菌条件下取脾.(3)把脾放入5ml含有2.5%FCS的1640液中,冰浴下轻轻洗去脾上的红血球.(4)用镊子轻轻挤压脾,做成脾细胞悬液,用毛细管将悬液移入小试管中.(5)直立小试管3min,使大块的结缔组织下沉,把细胞悬液移入离心管中.(6)以2.5%FCS—1640充满离心管,并以400g离心7min~10min(与此同时应开始制备骨髓细胞).(7)把沉淀用约10ml的新鲜培养液再悬浮.(8)重复⑹、⑺步骤.(9)计算细胞,以台盼兰染色用相差显微镜检查,活细胞数应高于80%为合格.(二)骨髓瘤细胞 骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋白,这样的瘤细胞融合后,可能影响或降低所分泌抗体的滴度,所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞.选择骨髓瘤细胞的条件:①该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系,以便两者的组织相容性抗原一致;②骨髓瘤细胞必须是静息状态,不产生γ球蛋白或不分泌到细胞外;③骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度,最好106个细胞/ml;④生长速度快,繁殖时间短.常用的Balb/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株有:①S194/5XXO·BU·1;②SP2/0—Ag14(简称SP2);③P2—X—Ag8·6·5·3(简称653);④FO以653最为常用,它是由矿物油4-甲基-15烷(Pristane,降植烷)诱发出来的一种浆细胞瘤(MinerolOilplasmacytoma,MOPC)并经过培育形成一株8-氮鸟嘌呤有抵抗力的亚系.骨髓瘤细胞一般由有关单位直接引入,保存于-195℃液氮罐中,试验时复苏、增殖、传代即可.由于骨髓瘤细胞是半贴壁状态,很容易脱落,因此不需要胰酶处理.为了防止出现返祖现象,在融合前,可将培养基内加入15μg/ml8-氮鸟嘌呤.取约1×107~6×107对数生长期(即培养15h~20h)的骨髓瘤细胞,在室温离心(400g)10min,沉淀以2.5%FCS—1640液再悬浮并计数.(三)饲养细胞 在体外的细胞培养中,单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖,必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖,加入的细胞称之为饲养细胞(Feedercell).在细胞融合和单克隆的选择过程中,就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体,因此在这一过程中必须使用饲养细胞.许多种类的动物细胞都可以做饲养细胞,如正常的脾细胞、胸腺细胞、腹腔渗出细胞等,常选用腹腔渗出细胞,其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞.应用腹腔渗出细胞的好处是:一方面做饲养细胞,另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片,为融合细胞的生长造成良好的环境.腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系鼠.也可以是其他种类的小鼠,如C57鼠,昆明小白鼠等.1.材料 (1)小鼠(Balb/c或C57小白鼠)若干只.(2)11.6%蔗糖溶液(经10磅30min高压灭菌).2.操作方法 (1)拉颈处死小鼠.(2)70%酒精浸泡消毒10min.(3)用手术剪将小鼠腹部剪开一小口,剥开皮肤,露出腹腔.(4)用注射器将4ml11.6%蔗糖溶液注入腹腔,用手指轻揉1min仍用该注射器回抽腹腔液体,加入离心管.(5)1000r/min离心10min.(6)取上清,以HAT选择培养液将细胞制成悬液.台盼蓝染色计数活细胞,使每毫升含40万个活细胞.(7)以1ml吸管将细胞种入微量培养皿,每孔0.05ml,含2万个细胞,放入CO2培养箱培养,即可供细胞融合和克隆化之用.如果在融合后发现在培养孔中饲养细胞数量少,则可以在细胞换液时再加入一些.
(3)2.5%FCS-1640营养液 2.操作方法 (1)拉颈或用CO2处死小白鼠.(2)将小鼠放于70%酒精中浸泡消毒,取出固定于板上,在无菌条件下取脾.(3)把脾放入5ml含有2.5%FCS的1640液中,冰浴下轻轻洗去脾上的红血球.(4)用镊子轻轻挤压脾,做成脾细胞悬液,用毛细管将悬液移入小试管中.(5)直立小试管3min,使大块的结缔组织下沉,把细胞悬液移入离心管中.(6)以2.5%FCS—1640充满离心管,并以400g离心7min~10min(与此同时应开始制备骨髓细胞).(7)把沉淀用约10ml的新鲜培养液再悬浮.(8)重复⑹、⑺步骤.(9)计算细胞,以台盼兰染色用相差显微镜检查,活细胞数应高于80%为合格.(二)骨髓瘤细胞 骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋白,这样的瘤细胞融合后,可能影响或降低所分泌抗体的滴度,所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞.选择骨髓瘤细胞的条件:①该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系,以便两者的组织相容性抗原一致;②骨髓瘤细胞必须是静息状态,不产生γ球蛋白或不分泌到细胞外;③骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度,最好106个细胞/ml;④生长速度快,繁殖时间短.常用的Balb/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株有:①S194/5XXO·BU·1;②SP2/0—Ag14(简称SP2);③P2—X—Ag8·6·5·3(简称653);④FO以653最为常用,它是由矿物油4-甲基-15烷(Pristane,降植烷)诱发出来的一种浆细胞瘤(MinerolOilplasmacytoma,MOPC)并经过培育形成一株8-氮鸟嘌呤有抵抗力的亚系.骨髓瘤细胞一般由有关单位直接引入,保存于-195℃液氮罐中,试验时复苏、增殖、传代即可.由于骨髓瘤细胞是半贴壁状态,很容易脱落,因此不需要胰酶处理.为了防止出现返祖现象,在融合前,可将培养基内加入15μg/ml8-氮鸟嘌呤.取约1×107~6×107对数生长期(即培养15h~20h)的骨髓瘤细胞,在室温离心(400g)10min,沉淀以2.5%FCS—1640液再悬浮并计数.(三)饲养细胞 在体外的细胞培养中,单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖,必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖,加入的细胞称之为饲养细胞(Feedercell).在细胞融合和单克隆的选择过程中,就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体,因此在这一过程中必须使用饲养细胞.许多种类的动物细胞都可以做饲养细胞,如正常的脾细胞、胸腺细胞、腹腔渗出细胞等,常选用腹腔渗出细胞,其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞.应用腹腔渗出细胞的好处是:一方面做饲养细胞,另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片,为融合细胞的生长造成良好的环境.腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系鼠.也可以是其他种类的小鼠,如C57鼠,昆明小白鼠等.1.材料 (1)小鼠(Balb/c或C57小白鼠)若干只.(2)11.6%蔗糖溶液(经10磅30min高压灭菌).2.操作方法 (1)拉颈处死小鼠.(2)70%酒精浸泡消毒10min.(3)用手术剪将小鼠腹部剪开一小口,剥开皮肤,露出腹腔.(4)用注射器将4ml11.6%蔗糖溶液注入腹腔,用手指轻揉1min仍用该注射器回抽腹腔液体,加入离心管.(5)1000r/min离心10min.(6)取上清,以HAT选择培养液将细胞制成悬液.台盼蓝染色计数活细胞,使每毫升含40万个活细胞.(7)以1ml吸管将细胞种入微量培养皿,每孔0.05ml,含2万个细胞,放入CO2培养箱培养,即可供细胞融合和克隆化之用.如果在融合后发现在培养孔中饲养细胞数量少,则可以在细胞换液时再加入一些.
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英语翻译
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